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熒光定量PCR儀選擇要規(guī)避的問題

更新時間:2016-04-21      點擊次數(shù):2174
   熒光定量PCR選擇的兩個誤區(qū):
  誤區(qū)一:儀器通道越多越好
  隨著PCR技術(shù)的成熟運用,多重擴增越來越熱鬧,熒光定量PCR儀也不能幸免。從zui初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀,眼花繚亂的選擇讓人無所適從,就有人一不小心走進了“通道越多越好”的誤區(qū)。
  在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時,為了確保實驗結(jié)果的性和準(zhǔn)確性都要在實驗中使用ROX(一種熒光染料)或的Reference dye ,這些熒光染料都必須單獨使用一個檢測通道。這樣以來,真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個,而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠家的的熒光染料或試劑開放的,有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購買前確認(rèn)熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要,不能單單只聽宣傳??紤]多重?zé)晒舛縋CR的通道數(shù)的時候也應(yīng)該從實驗室實際情況出發(fā),多重PCR并非人人適用、人人可用,因為它使實驗復(fù)雜化了。
  誤區(qū)二:real-time PCR儀無需梯度功能
  對于使用染料法的定量PCR反應(yīng),雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計軟件或者經(jīng)驗公式計算熔解溫度(Tm值),但運用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化,對于特殊片斷,經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準(zhǔn)確的結(jié)果,退火溫度細(xì)微的差異對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響,因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內(nèi)按照梯度變化,根據(jù)結(jié)果,一步就可以摸索出的反應(yīng)條件。
  不單退火溫度,連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個非常重要,因為Taq和校正酶的*反應(yīng)溫度可能有顯著差異,優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。
  使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優(yōu)化過程,簡化了摸索 PCR反應(yīng)條件的繁瑣實驗,既節(jié)省實驗時間提率,又節(jié)省實驗成本。

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